Suche nach krankheitsverursachenden genomischen Deletionen bei Patienten mit autosomal dominanter familiärer spastischer Paraplegie mittels multiplex amplifiable probe hybridisation (MLPA)


Antragsteller:

Christian Beetz, Dr. rer. nat., Institut für Klinische Chemie und Laboratoriumsdiagnostik Universitätsklinikum der Friedrich-Schiller-Universität Jena Erlanger Allee 101  07749 JENA

e-mail: christian.beetz@med.uni-jena.de

Die meisten Fälle von Familiärer Spastischer Paraplegie (FSP) lassen sich, trotz einer stetig wachsenden Zahl beschriebener Erkrankungsgen-Loci, auf Mutationen in einigen wenigen Genen zurückführen. Dies gilt insbesondere für die autosomal dominante Form (AD-FSP); in mindestens 50% der Fälle kann hier mittels Sequenzierung eine Mutation in SPG3A (Atlastin) oder SPG4 (Spastin) nachgewiesen werden. Es liegen allerdings auch eine Reihe von Studien vor, in denen solch eine Mutationssuche ergebnislos blieb, obwohl Kopplungsdaten die Involvierung eines dieser Loci nahe gelegt hatten. Die Identifizierung großer genomischer SPG4 Deletionen in zwei derartigen Fällen lässt auf einen bisher möglicherweise unterschätzten Anteil von Kopienzahlanomalien am Mutationsspektrum von FSP schließen.

Wir planen die Etablierung eines einfachen Screening-Verfahrens, mit dem standardisiert das Vorliegen von Kopienzahlanomalien bezüglich SPG3A und SPG4 untersucht werden kann. Als technische Plattform ist multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA), eine PCR-basierte Quantifizierungsmethode, vorgesehen. In Zusammenarbeit mit MRC-Holland (Niederlande) werden geeignete MLPA Sonden entwickelt, getestet und in einem Kit zusammengestellt. Dieser soll vorerst auf DNAs, welche am Institut für Klinische Chemie und Laboratoriumsdiagnostik der FSU Jena vorliegen, angewendet werden. Diese Proben sind im Rahmen früherer Studien intensiv auf das Vorliegen HSP-assoziierter Mutationen untersucht worden. Eine der DNAs, für welche eine Deletion der SPG4 Exone 13-16 nachgewiesen ist, wird während der Etablierungsphase als Positivkontrolle dienen. Auffällige MLPA-Befunde sollen per long-range PCR und/oder Southern Blotting Technik validiert und genauer charakterisiert werden. Für eine spätere Projektphase ist, in Kooperation mit anderen FSP-Zentren, die Untersuchung eines erweiterten Patientenkollektivs vorgesehen.

Die erzielten Ergebnisse sollten dazu beitragen, (i) die Inzidenz von Kopienzahlanomalien in SPG3A und SPG4 bei FSP Patienten besser zu beschreiben, (ii) über Art und Umfang der gefundenen Deletionen weitere Rückschlüsse auf den jeweils vorliegenden Pathomechanismus und damit mögliche Ansätze zur molekularen Korrektur zu ziehen und (iii) die routinemäßige Implementierung des Assays auf der Basis der erhobenen Kennzahlen vorzubereiten.

Abschlussbericht

Suche nach krankheitsverursachenden genomischen Deletionen bei Patienten mit autosomal dominanter familiärer spastischer Paraplegie mittels multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA)

Christian Beetz, IKCL, Uniklinikum Jena

Ziel des Projektes war die Ermittlung der Bedeutung genomischer Kopienzahlanomalien (Deletionen, Duplikationen) als Ursache für familiäre spastische Paraplegie (FSP). In einer ersten Phase wurde in Zusammenarbeit mit MRC-Holland (Niederlande) ein MLPA-Probenmix entwickelt, welcher die parallele Untersuchung von SPG3A (Atlastin) und SPG4 (Spastin) ermöglicht. Daran anschließend erfolgte eine Validierung dieses neuen diagnostischen Werkzeuges an Kontroll-DNAs und an FSP Patienten-DNAs mit einer mehrere Exone umfassenden SPG4-Deletion. Daraufhin wurden 65 FSP-Familien mit autosomal dominantem Erbgang und, bis dato,  negativer SPG4 Mutationsanalyse untersucht. Dabei wurden in 12 Fällen Hinweise auf sich im Ausmaß stark unterscheidende Deletionen des SPG4 Gens gefunden. Verschiedene Folgeuntersuchungen (Segregationsanalyse, cDNA Amplifikation, Identifizierung der Bruchpunkte) bestätigten diese Befunde und untermauerten die jeweilige Ursächlichkeit der Mutationen. Kopienzahlanomalien im SPG3A Gen wurden dagegen nicht beobachtet.

Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, dass mindestens 10% aller autosomal dominanten FSP-Fälle auf eine SPG4 Deletion zurückzuführen sind. Da diese offensichtlich hoch relevante Mutationsart mit den herkömmlich Screening-Methoden nicht erfassbar ist, bietet sich eine direkte Übernahme des hier entwickelten MLPA Testes in die Routinediagnostik an. Ein weiteres Ergebnis der Studie ist die indirekte Bestätigung der Hypothese von Haploinsuffizienz als Pathomechanismus bei SPG4 Mutationen. In diesem Zusammenhang sei vor allem auf drei Deletionen hingewiesen, die den 5'-Bereich des Gens betreffen und damit den Verlust jeglicher Transkription vom mutierten Allel nach sich ziehen sollten.

Die Publikation der Daten erfolgte in Neurology (Beetz et al., "High frequency of partial SPAST deletions in autosomal dominant hereditary spastic paraplegia", zur Veröffentlichung akzeptiert am 28.7.2006). Der entwickelte Test ist als "MLPA mix P165" von MRC-Holland beziehbar (www.mlpa.com).

von links nach rechts: Kerstin Stein, Bärbel von der Gönne, Heike Kiesewetter, Jörg Schickel, Christian Beetz, Cora Neumann, Anett Büschel