Charakterisierung spezifischer Interaktionspartner von Atlastin1

Prof. Auburger


Anbtragsteller:

Prof.Dr. Georg Auburger
Sektion Molekulare Neurogenetik
Klinik für Neurologie, Haus 26
Theodor Stern Kai 7, J.W. Goethe Universität,

60590 Frankfurt am Main
Tel: 069-6301-7428 FAX: 069-6301-7142
E-mail: auburger@em.uni-frankfurt.de

Zur Erforschung der Krankheitsmechanismen der Familiären Spastischen Paraplegie SPG3A ist es wichtig, das mutierte Krankheitsprotein Atlastin-1 hinsichtlich seiner subzellulären Lokalisation in Zellmembranen, seinem Netzwerk von Protein-Interaktoren, und seiner Funktion als GTPase verstehen zu lernen. Mit der Hefe-2-Hybrid-Technik haben wir einen Interaktor-Kandidaten identifiziert, der mehrere Ähnlichkeiten zum SPG-Krankheitsproteinn Spastin aufweist. Wir planen seine Gewebsexpression und subzelluläre Lokalisation zu studieren, cDNA-Klone voller Länge mit „tag“-Markern sowie auch Antikörper herzustellen, und damit Co-Lokalisations- und Co-Immunopräzipitations- Analysen zwischen Atlastin-1 und diesem Interaktor-Kandidaten durchzuführen. Die Ergebnisse werden hoffentlich Licht auf die biologischen Zusammenhänge zwischen mehreren Krankheitsproteinen der Spastischen Paraplegie werfen.

Ergebnisse:

 

  1. Im Rahmen eines Praktikums der Biologiestudentin Eva Luther in der Arbeitsgruppe Auburger wurde für verschiedene Zelllinien, für Mensch- und Rattengehirn sowie transfizierte HEK- bzw. HeLa-Zellen die Expression von Trax und Atlastin dokumentiert. Aus SH-SY5Y Zellen wurde ein Co-Immunpräzipitationsexperiment durchgeführt, aber bei Präzipitation von Trax aus Extrakten der gesamten Zellen wurde keine Assoziation mit Atlastin gefunden. Der anschließende Versuch, durch die Nutzung von Zellfraktionen eine höhere Konzentration der Proteine wirksam werden zu lassen, zeigte dass Atlastin und Trax mit Ausnahme von Nukleus und Mitochondrien in verschiedenen Fraktionen existieren, also nicht dauerhaft eine Assoziation an Vesikeln eingehen, dem wahrscheinlichen Wirkungsort von Atlastin. Eine Co-Immunpräzipitation aus diesen Fraktionen war erfolglos (Wegen Details siehe Powerpoint-Datei EvaLutherFinalPresentation07.ppt)
  2. Im Rahmen einer Diplomarbeit des Biologiestudenten Miguel Barrera in der Arbeitsgruppe Zimmermann wurden Expressionsklonierungen, Transfektionen und confokale Co-Lokalisationsstudien für Atlastin und DKFZp761B107 durchgeführt. Dabei zeigte sich für HA-Atlastin eine zytosolische Lokalisation perinukleär, entlang der Neuriten und an den Wachstumskegeln in Überlappung mit den Markerproteinen VAMP2 und Synaptophysin, während sich für Flag-DKFZp761B107 eine diffuse zytoplasmatische und nukleäre Verteilung zeigte (Wegen Details siehe AdobeAcrobat Datei Diplomarbeit Miguel Barrera.pdf).
  3. Im Rahmen der Dissertationsarbeit des Biologiestudenten David Nonis in der Arbeitsgruppe Auburger wurde ein Peptidantikörper gegen DKFZp761B107 generiert und eine Co-Immunopräzipitation von rekombinant transfiziertem GFP-Atlastin und HA-DKFZp761B107 in HEK-293 Zellen versucht. Bei guter Detektierbarkeit jedes einzelnen Eiweißes fand sich aber keine dauerhafte Bindung der beiden. (Wegen Details siehe PowerPoint Datei David Nonis Atlastin Co-IP and Antibody.ppt).

 


Diskussion:

Weder confokale Mikroskopie, noch Zentrifgationsfraktionierung, noch Co-Immunpräzipitation bestätigen eine dauerhafte Bindung von Atlastin mit Trax oder DKFZp761B107 in Säugergewebe, trotz der vielversprechenden Befunde im Hefe-System. Da Atlastin ein Membran-assoziiertes Eiweiß ist und die Hefe-2-Hybrid Methode deswegen die wirklichen Interaktorproteine schlecht darstellt, wären zukünftige Atlastin-Interaktionsuntersuchungen mit der TAP-Tag Methodik in Säugergewebe vorzuziehen, um das Interaktom und die Funktion von Atlastin zu verstehen. Die TAP-Tag Methodik ist derzeit in Frankfurt noch nicht etabliert. Die Grundlage für einen erfolgreichen DFG-Antrag zu Atlastin und Spastischer Paraplegie ist somit derzeit nicht gegeben.

Miguel Barera, Eva Luther, G. Auburger