Antragsteller:

Dr. Carola Sigrist, postdoctoral fellow, Stephan Sigrist, principal investigator Email: ssigris@gwdg.de, csigris@gwdg.de

Institution:

European Neuroscience Institute Göttingen Max-Planck-Institute for Biophysical Chemistry and Georg-August-University Göttingen Waldweg 33 37073 Göttingen

Zusammenfassung:

Hereditäre spastische Paraparesen (HSP) sind sowohl aus klinischer als auch aus genetischer Perspektive eine heterogene Gruppe von Erkrankungen, welche durch progressive Spastizität und Schwäche der unteren Gliedmaßen sowie durch Blasenbeschwerden und schwache Beeinträchtigung in der Wahrnehmung vibratorischer Reize charakterisiert sind (McDermott et al., 2000). Histopathologische Studien weisen auf ein Absterben kortiko-spinaler Axone hin, welches am terminalen Ende beginnt (Schwarz und Liu, 1956). Die Erkrankungen werden als “reine” (oder “unkomplizierte”) HSPs klassifiziert, wenn die oben beschriebenen Symptome isoliert auftreten bzw. als “komplizierte” HSPs, wenn sich zusätzliche neurologische Defekte wie mentale Retardation, extrapyramidale Symptome, Taubheit oder optische Neuropathien manifestieren.

Inzwischen konnten acht Gene identifiziert werden, die für HSP-Loci kodieren. Entsprechend der involvierten Proteine werden verschiedene Pathogenitätsmechanismen diskutiert: Störungen in Signaltransduktion oder Migration der Zellen, Abweichungen im Myelinierungsstatus der DNA, Abnormalitäten mitochondrialer Chaperone bzw. Defekte im intrazellulären Transport (Casari und Rugarli, 2001, Crosby und Proukakis, 2002).

Die Pathogenitätsgene spastin (SPG4), spartin (SPG20, Troyer Syndrom) und atlastin (SPG3A) werden mit dem intrazellulären Transport von Proteinen und/oder Vesikeln in Zusammenhang gebracht (relevante Mutationen in den erwähnten Genen finden sich in Reid, 2003-1 und-2). Es sind jedoch zwingend funktions-genetische Studien erforderlich, um einen solchen Zusammenhang weiter zu erhärten.

In diesem Zusammenhang sollten Tiermodelle, die auch das direkte Studium von Transportprozessen in lebenden und genetisch zugänglichen Zellen erlauben, besonders geeignet sein. Die Fruchtfliege Drosophila melanogaster hat sich in den letzten Jahren als effizientes und informatives Modell für verschiedene neurodegenerative Erkrankungen erwiesen. Dies insbesondere, da etwa 80% aller humanen Pathogenitäts-relevanten Genfunktionen in der Drosophila evolutiv konserviert sind.

Der vorgelegte Projektantrag konzentriert sich auf drei HSP-Gene (spastin, spartin und atlastin), die für eine Mehrzahl der HSP Fälle verantwortlich sind. Diese Gene sollen auf genetischem Wege in der Fruchtfliege funktionell charakterisiert werden. Hierbei dürfte der Vergleich zu bereits charakterisierten Genen und Signalwegen besonders interessant sein. Unsere genetischen Arbeiten sollten es auch erlauben, die pathologisch relevanten Mutationen in den betrachteten HSP Proteinen genetisch weiter zu klassifizieren (z.B. dominant aktiv/negativ contra haplo-insuffizient). Derart gewonnene Erkenntnisse könnten auch für potentielle Therapieansätze relevant sein. In einer späteren Phase des Projekts soll untersucht werden, inwieweit HSP Proteine Einfluss auf den intrazellulären Transport, insbesondere axonalen Transport synaptischer Proteine nehmen.

Für das in vivo Studium der HSP Genfunktionen werden zur Zeit mit Hilfe von Transposon-Mutagenese Fliegenstämme etabliert, in denen die entsprechenden HSP Gene eliminiert sind. Parallel dazu sollen RNA-Interferenz-Experimente während der Drosophila Entwicklung Aufschluss über die Zeit-und Gewebs-spezifische Rolle der betrachteten Faktoren liefern. Die HSP Proteine werden auch im Hintergrund der entsprechenden Mutanten zur Expression gebracht. Dadurch kann der spezifische Charakter der betrachteten Mutation sichergestellt werden. Weiterhin lassen sich vermittels solcher genetischer „Rettungs-Experimente“ („rescue assays“) Struktur-Funktions-Relationen für relevante Gene erstellen. Zu diesem Zwecke sollen die humanen Mutationen auch in konservierte Positionen der entsprechenden Drosophila Proteine eingeführt bzw. die humanen Proteine in den entsprechenden Drosophila Mutanten auf Funktionalität getestet werden. Einführung pathologischer Mutationen und zumindest teilweise „Humanisierung“ der exprimierten Proteine erlauben dann unter anderem die oben angesprochene genetische Klassifizierung pathologisch relevanter Mutationen.

In einer späteren Phase des Projekts wird ein besonderer Fokus auf die Charakterisierung potentieller Defekte im axonalen Transport gelegt. “Transport-Stau” in Axonen bzw. defekte Versorgung auswachsender Synapsen können in den leicht zugänglichen neuromuskulären Axonen und Synapsen von Drosophila-Larven direkt nachgewiesen werden. Der axonale Transport wird hierbei entweder in akut geöffneten oder auch intakten Larven mit Hilfe konfokaler Mikroskopie visualisiert werden. Dazu wird axonales Transportcargo (Mitochondrien, synaptische Proteine) vermittles GFP-markierter Transgene im Nervensystem exprimiert. FRAP- („fluorescence recovery after photobleaching“) Experimente erlauben es dann, axonale Transportraten direkt quantitativ zu erfassen. Der axonale Transport kann somit bei gleichzeitiger Beeinflussung von HSP Proteinen (Mutanten, RNA-Interferenz, Überexpression) direkt vermessen werden. Die Funktion der von defektem axonalen Transport betroffenen Synapsen wird in einem zweiten Schritt vermittels Elektrophysiologie und gegebenenfalls auch Elektronenmikroskopie untersucht. Wir hoffen hierdurch eine integrierte Analyse von axonalem Transport, synaptischer Funktion und axonaler Degeneration in einem genetisch leicht zugänglichen Modellsystem möglich zu machen.

Für eine detaillierte mechanistische Analyse soll schließlich auch die subzelluläre Verteilung von Spastin, Spartin und Atlastin studiert werden. Mit Hilfe von gegen diese Proteine hergestellten Antikörpern und GFP-Fusionsproteinen wird es möglich sein, die Proteine in lebenden Drosophila-Larven zu detektieren. Zudem liegt ein langfristiges Interesse im Auffinden von Bindungspartnern der HSP Proteine, welche weitere Informationen über die zellulären und molekularen Funktionen der Proteine liefern könnten.

Die in diesem Antrag geschilderten Techniken sind zum größten Teil schon im Labor voll etabliert bzw. können relativ kurzfristig etabliert werden. In punkto des Studiums axonalen Transports sind rege Kontakte zur Arbeitsgruppe von Larry Goldstein (UCLA), einem führenden Experten dieses Gebiets, hergestellt.

Mit Hilfe der geschilderten Experimente soll unser Einblick in die primären mechanistischen Ursachen der HSP Erkrankungen erweitert werden.